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【方法优化】食品中酸性橙II前处理优化思路

发布时间:2019-12-25        内容来源:月旭科技

 

非食用着色剂酸性橙Ⅱ,Acid Orange 7,染料索引号:C.I. 15510,是一种常用的工业染料,有强致癌性。因其色泽鲜艳、匀染性好、价格低廉等特点,酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生产加工,因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用着色剂的检测范围。目前,国家已经发布3个推荐性的食品中酸性橙Ⅱ专用检测标准,但由于不同实验室间仪器、人员、实验耗材、样品等条件存在差异,完全执行方法就能达到回收率、精密度要求的情况很少。因此,根据实际情况进行方法的优化是必要的。


最近,小编在用不同的基质按照标准《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》做酸性橙Ⅱ回收实验时,发现回收率不很理想,而且6.1.2所规定的固态样品前处理方法非常耗时(特别是净化前提取液需“浓缩约至10mL”这一步)。因此小编依据标准方法对不同实验环节进行了一些优化,在这里将全过程分享给各位朋友以供参考交流~


样品净化步骤

样品净化步骤优化涉及SPE小柱与滤膜的选择、固相萃取操作步骤。

首先,我们需要按标准方法进行实验,验证所用SPE小柱与滤膜是否满足当下实验条件需求:


1. 根据标准3.6节(见下图)选择对应的SPE小柱。

 

由此,小编选择了月旭Welchrom® NH2小柱(500mg/6ml,30pk,货号:00509-11006)。


2. 使用酸性橙Ⅱ标准溶液,按标准6.1.3节的净化方法(见下图)进行固相萃取操作(小柱的活化方法见3.6),留取每一操作步骤的样液用于上机检测。 


在这里,小编移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ标准溶液,加10mL水混匀作为上样溶液,并根据6.1.3分别收集上样液、淋洗液、洗脱液、二次洗脱液进行上机检测(此方法又称“分步留样”,是分析SPE操作过程中影响回收率的环节及原因的常用方法)。


3. 选择合适的滤膜过滤样液,上机检测。

根据6.1.3,样液上机前要过膜净化。我们都知道,滤膜作用是净化样液,防止杂质污染贝博柱。但使用滤膜(或使用不合适的滤膜)可能会影响目标物的回收率甚至引入杂峰。因此,小编尝试了三种过膜方式:1) 不过膜;2) 水系滤膜;3) Nylon滤膜。



蓝色为样液不过膜,峰面积12.0191

粉色为样液过水系滤膜,峰面积11.4695

黑色为样液过Nylon滤膜,峰面积6.4975

结果发现过膜后,过膜样液的图谱峰面积:过Nylon滤膜<过水系滤膜<不过膜,说明过水系膜或有机系膜都对目标物造成一定损失。因此后续实验的样液均不过膜上机。建议本实验样液上机前不过膜。


最后,小编发现上样液、淋洗液以及两次的洗脱液中都没有目标物酸性橙Ⅱ检出,酸性橙Ⅱ最终的回收率已经达到了95%-105%,满足了检测的要求。


样品提取步骤优化


其次,按照标准方法小编进行了空白基质加标实验,验证样品提取步骤是否影响不同基质样品中目标物的回收。实验方法如下图所示。、


 


实验过程中,小编发现:

6.1.2固态试样提取方法中提及:要用20mL乙醇-氨溶液(配制方法见3.4)提取2遍,再合并提取液,浓缩至10mL。

此时洗脱液总量约40mL,需40℃浓缩至10mL左右【相当于除去乙醇】。整个浓缩过程非常耗时,差不多处理一个样要一小时,而且最终的结果回收率非常不理想。

按照第一次实验的结果,小编进行了一些优化,标准上是全部提取液浓缩至10mL左右后净化,改为移取了其中20mL经浓缩至约5mL后上样。

根据第二次实验结果,回收率已经达到了90%-100%,满足了检测的要求。


最终优化后的实验步骤和谱图


一、提取

称取样品2g(±0.01g)于50mL离心管中,加入20mL乙醇-氨溶液,超声提取30min,离心10min(4000r/min),吸取上清液于另一50mL离心管中;残渣中加入20mL乙醇-氨溶液,重复提取一次,合并两次上清液,混匀,准确移取20mL上清液,40℃旋转蒸发至少于5mL,转移至15mL离心管中,用水定容至10mL,待净化。


二、净化

SPE柱:月旭Welchrom® NH2规格:500 mg/6mL

活化:依次用5mL甲醇,5mL2%甲酸水溶液过柱,弃去流出液

上样:将待净化液全部上样,自然流干,弃去流出液

淋洗:依次用5mL2%甲酸水溶液,再用5mL甲醇淋洗小柱,弃去流出液

洗脱:用5mL10%氨水甲醇溶液,收集于15mL试管中,抽干小柱

浓缩:氮吹至近干,用水定容至1mL,上HPLC检测。



三、仪器条件

贝博柱:月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm

流动相:乙酸铵:甲醇=35:65

柱温:35℃

进样量:20μL
检测波长:484nm

流速:1.0mL/min



总结

在优化标准方法的时候:

1)先选择合适的SPE小柱,用目标物标准溶液进行固相萃取操作,分步排查SPE步骤,确认小柱与标准方法是否满足具体要求;

2)再按标准方法,做空白基质加标,确认前处理样品提取步骤中目标物的损失情况,分析造成目标物损失的原因及步骤,有针对性优化方法;

3)接着做样品和样加标,看目标物回收率情况,优化提取量或提取次数;最后得出一个稳定的方法,保证满足标准回收率要求进行检测。


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